如何選擇合適的蛋白染液的蛋白含量測定方法

　　對許多實驗來說，確定蛋白樣品濃度是至關(guān)重要的。如果在2D電泳中，蛋白過多或過少，產(chǎn)生的后果都將是相當嚴重的。大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標儀檢測，并與已知濃度的蛋白標準曲線作比較。Bio–Rad 提供了4種蛋白測定手段，每種都有其獨特的優(yōu)點。

　　Quick Start Bradford 蛋白測定是一種簡單、精確的蛋白濃度定量方法?，F(xiàn)成的1倍濃度染料和7個預(yù)稀釋濃度(0.125、0.25、0.5、 0.75、1.0、1.5、2.0 mg/ml)的蛋白標準品，讓你擁有現(xiàn)成的檢測工具。無需稀釋標準品和染料，一步完成蛋白濃度定量。

　　Bio–Rad 蛋白測定也是一種簡單的蛋白濃度測定方法。該方法適應(yīng)標準濃度測定、低濃度微量測定，或96孔板的快速測定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一樣的，不過要麻煩一點點。因為除了要稀釋蛋白標準品，配成幾個不同濃度之外，還要稀釋染料，再過濾除去不溶顆粒。后面的步驟就沒有區(qū)別了，還有一點小差別就是價格。不過聯(lián)想一下奶粉和液體奶，就會想通了吧。

　　Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白測定方法的起源都是Bradford染料結(jié)合方法 (Bradford 1976)，該方法檢測考馬斯亮藍G–250染料與蛋白結(jié)合時(主要結(jié)合堿性或芳香族氨基酸殘基)的顏色變化。這種測定方法能定量多數(shù)蛋白或多肽(分子量> 3,000–5,000 Da)，操作簡單、速度快，靈敏度高，與一些還原劑(如DTT、巰基乙醇)兼容。但有些去垢劑、黃酮、堿性緩沖液會干擾測定。

　　DC (Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用于含有去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。該方法類似于常規(guī)的Lowry 測定方法 (Lowry et al.1951)，但經(jīng)過改良，節(jié)省了操作時間。DC 蛋白測定只需要15分鐘的溫育過程，而且吸光值讀數(shù)能保持2小時的穩(wěn)定。它可以兼容NaOH和多種去污劑，如10% SDS、2% NP-40、1% CHAPS、1% Triton X-100等，但還原劑還是會干擾測定。

　　RC DC (Reducing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白測定是一種適用于含還原劑和去垢劑的蛋白樣品比色測定方法。以 Lowry 方法(Lowry et al.1951)為基礎(chǔ)的 RC DC 蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點，并能與更多的試劑兼容，簡化了復(fù)雜蛋白樣品溶液的定量測定。吸光值至少穩(wěn)定1小時。除了與DC 蛋白測定兼容的試劑外，RC DC 蛋白測定還與以下試劑和緩沖液兼容：2% CHAPS、350 mM DTT、0.1M EDTA、Laemmli 緩沖液、10% beta-巰基乙醇、ReadyPrep 抽提試劑等。

　　選擇合適的蛋白標準

　　大家可能從來沒有在意過蛋白標準，認為不就是BSA嘛。其實不然。在蛋白測定中，最好的標準品是待測蛋白的純化制品。當沒有這種絕對的對照蛋白時，可以選擇另一種蛋白作為相對標準。如果是用Bradford方法測定，不同的標準品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。因此在蛋白測定之前，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。如果只需要相對蛋白濃度，那么任何一種純化蛋白均可作為對照標準品。

　　Bio–Rad 提供兩種蛋白標準品，小牛球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)標準品。當你用Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度時，那么標準品的選擇就要慎重一些。如果你的樣品中主要含有白蛋白，那么BSA將是一個好選擇。如果你的樣品包含了多種蛋白，gamma-球蛋白可能更合適。而DC和RC DC蛋白測定就幾乎不受到標準品的影響，你愛選哪個選哪個。不過假如你想比較幾個蛋白的量時，最好還是用同一種標準品。

　　選擇合適的蛋白測定方法

　　正如一個硬幣的正反面，每種蛋白測定方法都有其優(yōu)缺點。當你選擇一種蛋白測定方法時，需要考慮兩個重要因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測的蛋白量?；?Bradford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測定靈敏度高，可以兼容糖、巰基乙醇、DTT等。而對于去污劑和NaOH這兩種干擾Bradford測定的物質(zhì)，DC蛋白測定卻可以兼容。如果蛋白是在loading buffer中，準備跑1D或2D電泳，或者剛從細胞裂解液中抽提出來，需要定量，那么RC DC蛋白測定更合適。下表總結(jié)了每一種蛋白測定方法的特點。

　　比色皿

　　最后還要提一下比色皿這個小東西。一般定量核酸和紫外定量蛋白，都是采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定蛋白質(zhì)。因為反應(yīng)中的染料(如考馬斯亮藍)能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。Bio-Rad也提供了一次性的比色皿。這些比色皿可直接用于樣品的混勻，這樣你就省掉了轉(zhuǎn)移溶液的麻煩。而且比色皿所需的樣品體積只是標準反應(yīng)的一半左右，因此每個試劑盒的使用次數(shù)實際上變成了兩倍。另外，它的非光學(xué)面是凹槽設(shè)計，非常容易拿捏，而且不容易搞錯，在光學(xué)面上留下指紋或在分光光度計中放反了方向。

　　蛋白定量這個看似簡單的實驗中，也蘊藏了不少學(xué)問，所以還是要有一雙慧眼，來選擇最適合的試劑盒。