western blot反應步驟及注意事項
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗.經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變.以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分.該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達.
1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當?shù)牧呀庖海呀赓N壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發(fā)生的電泳過度。
通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer)
通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
4. 封閉(Blocking)
轉膜完畢后，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。
用滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。
回收一抗。在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
注：Western結果通常需要提供內參作為對照
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書，二抗需根據(jù)一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
回收二抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
參考一些文獻資料進行檢測
孵育過程推薦使用專用孵育盒（Crystalgen進口孵育盒F6632），節(jié)省抗體.
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1、孵育盒
