細胞培養(yǎng)的成功跟細胞消化有關(guān)嗎？

細胞培養(yǎng)的成功跟細胞消化有關(guān)嗎？

導讀

因為一些特殊的原因，培養(yǎng)接觸過近300種細胞，常用于做實驗的，累積有百余種，可以說遇到過各式各樣古怪的細胞。這里挑細胞消化做一篇專題，并不是因為細胞消化最重要，而是近期看到大家頻繁討論這個話題，我就拋磚引玉，下面幾點拙見，可能與其它朋友總結(jié)的一些經(jīng)驗有點出入，僅供大家參考。

細胞消化的一般程序步驟，細節(jié)操作，我這里就不講了，只講一些基本操作背后的知識，如有不妥之處，歡迎指正，一起討論：

1. 絕大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化。

2.怎么樣算是消化好了呢？不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完全分離細胞，這是沒有必要的。一般能移動了，說明細胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細胞就是完全成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性，無論死活的細胞都是如此，你可以嘗試，準備100%的單個細胞懸液，貼壁后觀察細胞，仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液（不要笑，這個是初養(yǎng)懸浮細胞的人常犯的錯誤，以為懸浮培養(yǎng)就是一個一個分開）。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個時候即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間，或者象有的同學那樣吹打1h，等待單細胞懸液出現(xiàn)。

3.另一個帖子里提到一個比較復雜的四步消化法，這個挺有意思，我也是第一次聽說，應該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來的方法，很有參考價值。但我估計這個方法可能對付少數(shù)非常怪異的細胞才需要這么復雜的程序。我目前養(yǎng)過的近300株細胞里面，還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實是很好消化的細胞，不需要胰酶孵育即可，只是有點成片分布。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個視細胞而定。如果和標準形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細胞之后會對你越來越不好。

4.比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），就以coloncancer為例，比如HCT15,LS411和KM12，這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞，一般不超過5min，即可見細胞成片移動，就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候，比如tsDC細胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

5.常規(guī)的細胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化（難消化細胞例外）即可。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細胞代數(shù)，對細胞狀態(tài)要求極高。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細胞包裝能力就會逐漸下降（當然也有其它因素影響包裝效率）。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

6.EDTA的作用。許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不徹底的話），而應該想其它辦法。

7.PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學問可以講，對于一些難消化細胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞，不需要配制如此溶液。

總結(jié)下來，雖然這篇文章是關(guān)于消化的，但其實消化并不是細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵所在（雖然很重要），關(guān)鍵所在是細胞來源，血清質(zhì)量和水源（自己配制溶液的話）。我看到版上許多人養(yǎng)細胞遇到各種各樣的問題，很多時候bottleneck沒有找到，雖然通過其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因為人們往往注意自己的操作，總覺得自己沒有經(jīng)驗，而忽視試劑，溶液尤其是細胞的質(zhì)量，后者其實才是許多細胞培養(yǎng)實驗室常見的問題。

1分辨血清來源，切勿上當受騙由于瘋牛病的原因，到目前為止我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等有疫情的地區(qū)進口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲（SAFC牛血清的血源，Corning的澳洲胎牛血清的血源就是來自澳洲嗒）、南美洲，或是國產(chǎn)的。至于來源于巴西的、以色列的血清，大家還是看看就好，切莫隨意行動。

2嚴查生產(chǎn)質(zhì)檢，減低批間差別血清批次間的差別是不可避免的，這種差異來源于不同的制備方法和除菌方法、動物的年齡差別、血清的儲存條件、動物的來源等。因此血清的生產(chǎn)、過濾、消毒、質(zhì)檢流程的嚴格控制以及長期穩(wěn)定的血清供應更顯的尤為重要，這一點國產(chǎn)的很多血清就望塵莫及啦。